基于微阵列的高通量蛋白质检测技术研究进展

生命科学仪器 2020 第18卷 /08月刊综述基于微阵列的高通量蛋白质检测技术研究进展赵可心，吕雪飞*，李晓琼，邓玉林（北京理工大学生命学院，北京，100081）摘要： 蛋白质检测作为体外诊断技术之一，在疾病筛查、重症监测和传染病防控等领域发挥着重要作用，但传统检测方法存在操作复杂、成本高，耗时长等问题，难以实现简便、快速、高通量的检测。以微阵列技术为基础的免疫检测方法具有体积小、成本低、分析速度快及可并行检测等特点，有望成为一种理想的高通量蛋白质检测手段。本文围绕平面型微阵列检测芯片、微珠阵列检测芯片和悬浮微阵列三类技术及其应用，在介绍检测原理的基础上，重点关注了平面型微阵列检测芯片的表面修饰和探针分子打印技术、微珠阵列检测芯片的装配和信号分析技术以及悬浮微阵列的编码技术等。最后，提出了制约微阵列技术临床应用的几个挑战，并对其与便携式检测设备集成的可行性进行了展望。关键词：高通量检测；微阵列；芯片；蛋白质检测；综述中图分类号：O65 文献标识码：A DOI: 10.11967/2020180804Progress of Microarray-based Techniques for High-throughput Protein DetectionZHAO Kexin，LV Xuefei*，LI Xiaoqiong，DENG Yulin(School of life, Beijing Institute of Technology, Beijing, 100081 )Abstract: As one of in vitro diagnosis technologies, protein detection plays an important role in the fields of screening of diseases, monitoring of therapeutic effects, and prevention and control of infectious diseases. However, traditional detection methods have the problems of tedious operation, high cost, huge time consumption, and so on, which do not allow simple, rapid and high-throughput detection. Microarray -based immunoassays have advantages of small size, low cost, fast analysis and parallel detection ability, which are expected to be ideal methods for high-throughput protein detection. This paper focused on three techniques which are planar microarray chip, bead-based microarray chip and suspension microarray, whose applications were also summarized. The principles of detection of the three parts were explained separately as well as the surface modification and probe printing processes of planar microarray chips, the assembly and signal analysis techniques of bead-based microarray chips, and the encoding methods of suspension microarrays. Finally, several challenges restricting the clinical applications of microarray technology and the feasibility of integrating it with portable testing equipment were concluded and prospected.Key Words：High-throughput detection; Microarray; Chip; Protein detection; Review[CLC Number] O65 [Document Code] A DOI: :10.11967/2020180804基金资助信息：空间站工程航天医学领域实验项目（HYZHXM04001）作者简介：赵可心（1995-）、男、硕士研究生、以微流控芯片为平台，进行生物分子的高通量检测，Email：zhaokx0604@foxmail.com通讯作者：吕雪飞(1979-)、女、博士、副教授、硕士生导师、以蛋白质为研究对象，以微流控芯片等技术为手段，开展前沿性的分离分析新技术新方法研究，重点解决蛋白质组学、临床诊断以及空间生命科学对新技术新方法的需求。E-mail：xuefeilv@163.com，办公电话：010-68914607。27综述生命科学仪器 2020 第18卷 / 08月刊1、 引言多种血清蛋白质标志物的并行检测能够揭示某些复杂疾病（如癌症[1-3]、心脏病[4, 5]及囊包性纤维症[6, 7]等）的关键信息，为诊断提供重要依据。此外，多重免疫检测还被广泛用于细菌、病毒、真菌和寄生虫等的筛查和分析中[8]。以酶联免疫吸附[8, 9]（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）为主的免疫检测方法能够实现多种蛋白质的定量检测，但是这些传统方法对样品和试剂的需求量大，操作复杂，影响因素较多。因此，迫切需要一种快速、灵敏、准确并且可实现高通量并行检测的新技术，以克服传统免疫检测方法的缺点，为疾病诊断和微生物分析等领域提供有力的手段。随着微加工技术的不断进步，以微阵列技术为基础的高通量免疫检测方法展现出巨大的发展潜力。微阵列技术是一种功能强大的蛋白质和其他生物分子的高通量并行检测技术[10, 11]，其本质是在同一芯片上进行大量生物信息的平行分析，使一些传统的生物学分析手段能够在尽量小的空间范围内，以尽量少的试剂和尽量快的速度完成。微阵列技术可实现多目标的并行检测，为传统免疫检测方法提供了有效的替代方案。蛋白质微阵列检测芯片的设想在1989年被提出[13]，在本世纪初期成功用于免疫检测[14,15]。免疫分析的微型化不仅改善了信噪比，提高了灵敏度，还具有体积小、成本低、分析速度快、可并行检测、试剂消耗微量化等优点，越来越发展为一种理想的高通量检测工具[16]。本文围绕平面型微阵列检测芯片、微珠阵列检测芯片和悬浮微阵列三类技术及其应用，在介绍检测原理的基础上，重点关注了平面型微阵列检测芯片的表面修饰和探针分子打印技术、微珠阵列检测芯片的装配和信号分析技术以及悬浮微阵列的编码技术等。最后，提出了制约微阵列技术临床应用的几个技术挑战，并对其与便携式检测设备集成的可行性进行了展望。282 、 平面型微阵列检测芯片及其应用 平面型微阵列检测芯片通常具有刚性基底，最为常见的是玻璃显微镜载玻片[17]和硅片[18]等。这些材料经过适当的表面化学处理后，将捕获探针按照一定的空间排列固定在直径为100-250 mm的微点上，捕获样品中与之匹配的目标分子。未与捕获探针结合的分子经洗脱步骤除去，被捕获的目标分子则用荧光标记的检测探针（通常是针对同一蛋白其他表位的抗体）进行检测[19]。根据目标分子和探针分子的种类不同，平面型微阵列检测芯片也有不同的设计方案（如图1），包括蛋白质/多肽微阵列检测抗体（夹心法）、核酸适配体/抗体/多糖微阵列检测抗原（直接法）、核酸适配体//抗体/多糖微阵列检测抗原（夹心法）以及反相微阵列检测抗原。图1 平面型微阵列检测芯片示意图（a）蛋白质/多肽微阵列检测抗体,（b）核酸适配体/抗体/多糖微阵列检测抗原（直接法）,（c）核酸适配体/抗体/多糖微阵列检测抗原（夹心法）,（d）反相微阵列检测抗原Fig. 1 Schematics of different types of protein microarrays. (a) Protein/peptide microarrays for antibody detection. (b) Aptamer/antibody/sugar microarrays for antigen detection (direct mode). (c) Aptamer/antibody/sugar microarrays for antigen detection (sandwich mode). (d) Reverse phase microarrays for antigen detection.蛋白质/多肽微阵列（图1a）是将蛋白或多肽作为捕获探针，以一定规律固定在基底表面，而经荧光标记的二抗作为检测探针，对样品中的抗体进行高通量检测，常用以进行过敏测试（检测过敏原特异性IgE）或自身免疫病诊断[20]。图1b及图1c展示了用平面型微阵列检测芯片进行高通量抗原分析检测的方案。将抗体作为捕获探针，以一定规律固定在基底表面，捕获样生命科学仪器 2020 第18卷 /08月刊综述品中与之匹配的抗原，进而通过荧光标记的检测探针（针对抗原其他表位的抗体）进行检测（图1c），或通过对样品中抗原进行荧光标记的方法进行直接检测（图1b）。可用于指示生物或环境样本中的各种目标分子含量。图中所示的捕获探针除了常见的抗体[21]通过适当的连接分子，实现捕获探针的选择性固定。与三烷氧基硅烷相比，长链烷基三氯硅烷由于长脂肪链的自组装特性，可在基底表面形成高度有序、密集排列的类固态单分子层[29]，因此对硅醇基团的反应性更强，也常被用于硅基底材料表面的化学修饰。过渡金属材料制成的基底（通常为金和银）可以使用含有巯基（-SH）或硒醇（-SeH）基团的化合物进行修饰[30]。例如，用烷硫醇对金表面进行化学衍生是目前最常用的方法之一[31]。Camarero等人研究了几种有效改性烷硫醇化合物的制备技术[32, 33]，并用于在金表面选择性的固定功能性蛋白质分子。一些有机聚合物材料，例如聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）和聚碳酸酯（polycarbonate，PC）等，被认为是无机基底材料的潜在替代品，也常用于平面型微阵列检测芯片的制作[34]。使用这些材料作为基底时，同样需要进行适当的表面修饰，使蛋白质能固定在特定的反应位点上。例如，对PDMS材料进行表面等离子体氧化，然后用有机硅烷对表面进行功能化处理[35]；使用1,6-己二胺（1,6-Hexamethylenediamine，HMDA）对PMMA进行处理，引入活性氨基[36]；在PC表面进行磺化反应，引入磺酰基[37]等。外，还包括核酸适配体（如Cho等人利用两种RNA适配体和两种DNA适配体同时检测四种常见蛋白：溶菌酶、蓖麻毒素、IgE和凝血酶[23][22]）与多糖（如Erino等人利用平面型微阵列技术研究固定化糖基质与凝集素相互作用）。除了上文所述的抗原或抗体检测，平面型微阵列检测芯片还具有反相微阵列的形式（如图2d）。首先将血清、血浆、组织等复杂样本以阵列形式固定于基底表面，随后与荧光标记的已知抗体结合，以确定样本中目标蛋白质含量的差异[24,25]。例如将病原体蛋白（如病原菌效应因子）与来自宿主的蛋白质组微阵列芯片共同孵育，高通量筛选出宿主蛋白质组中潜在的，可与病原体蛋白结合的目标蛋白质[26]。2.1 平面型微阵列检测芯片性能的重要影响因素无论是哪种形式的平面型微阵列检测芯片，都必须具有如下两个特点：（1）具有很高的探针结合能力，在不改变探针活性构象的前提下，使其固定在基底表面，并促进探针与目标分子的相互作用；（2）能有效抑制探针与生物样品的非特异性相互作用[27]。上述两个特点往往会受到基底的表面理化性质及探针分子固定方式的共同影响[28]2.1.2 探针分子打印技术平面型微阵列检测芯片需要采用合适的打印技术来提高检测结果的稳定性[38]。微阵列芯片上探针分子的打印技术主要包括接触式[39]与非接触式[40]。接触式打印是指点样仪的固体针脚与芯片表面直接接触，将储液器中的蛋白质溶液通过毛细作用直接沉积于阵列表面。这种方法设备简单、成本低、速度快，然而这种方法难以对每个位点29。2.1.1 表面修饰技术平面型微阵列检测芯片常用的基底材料包括硅、玻璃、金属和聚合物材料等。3-氨丙基三乙氧基硅烷或 3-巯基三烷氧基硅烷等通常被用做硅基底材料表面的化学修饰试剂，分别引入氨基（-NH2）和巯基（-SH）基团。这些基团可以综述生命科学仪器 2020 第18卷 / 08月刊沉积的探针进行精确定量，且物理沉积的方法也可能会对蛋白质活性产生一定影响。Wu等人[41]建立了流体静力模型，对接触式打印进行分析，对针尖宽度、倾角、针尖与基底的接触角等参数进行优化，显著提高了打印过程的稳定性和可重复性。非接触打印也被称作压电式打印，是指通过一次电脉冲将一滴微量的蛋白质溶液分配到芯片表面的位点上，避免了点样器的针脚与芯片直接接触。由于可以在同一位点多次加样，因此，这种方法可以实现样品体积的分步变化，能够精确定量，具有很高的重复性。另外，这种打印方法不受物理针脚安排的限制，可实现更丰富的图案设计。其缺点是成本高、速度慢、且不适用于粘性高的溶液等[42]。此外，针对平面型微阵列检测芯片质量控制难的问题，Marina[43]等人开发了一种基于硅/二氧化硅材质的平面型微阵列检测芯片的通用型设计加工平台，可以对不同位点的加样一致性进行检验，还可以优化不同蛋白质的溶解和结合条件，将蛋白质微阵列检测的灵敏度优化至pg/mL。技术筛选得到了一组用以区分寨卡病毒和登革热病毒感染患者的血清生物标志物，包括来自寨卡病毒和登革热病毒的NS1、NS2A、NS3、NS4B和NS5蛋白，以及来自寨卡病毒的衣壳蛋白。Yang等人[50]分析了8个胃癌患者样本，筛选出17种潜在的肿瘤标志物，随后用这些蛋白质构建微阵列芯片，并用另外914个样本中的抗体进行验证，结合ELISA和组织芯片技术，最终成功筛选得到了四种与胃癌密切相关的肿瘤标志物。Gupta等人[51]将脑膜瘤患者样本的检测结果与蛋白质组学和GEO数据库的基因表达谱相结合，筛选出了两种脑膜瘤相关的血清生物标志物SELENBP和TPD52。单目标检测不足以用于较为复杂的或由病毒感染引起的疾病的诊断。为了增加检测的敏感性和特异性，往往需要对多个血清生物标志物进行高通量并行分析。通过类似的策略，可以筛选得到更多疾病相关的血清生物标志物，并被进一步用于新的诊疗方案中。2.2.2 识别新的酶和底物近酶是一类重要的功能蛋白，它们参与大多数生理过程，如基因表达调控、细胞分裂、信号转导等。识别具有明确酶活性的蛋白质及相应底物是酶研究的关键内容之一[24]，作为高通量筛选平台的平面型微阵列检测芯片在识别新的酶和底物方面发挥了重要的作用。Tu等人[52]基于平面型微阵列技术发展了一种“夹子芯片（clip-chip）”，用于从大肠杆菌蛋白质组中筛选具有去乙酰酶活性的酶（图2）。将乙酰化的底物基片与大肠杆菌的蛋白质组微阵列芯片对接，使芯片上的蛋白质与底物发生反应。反应结束的底物基片经过冲洗后，再与荧光染料Cy3标记的抗乙酰-L-赖氨酸抗体结合。若某个位点的荧光强度明显较弱，则说明对应的蛋白质组微阵列芯片上的蛋白质可能是赖氨酸去乙酰化酶。通过这种方式筛选得到了大肠杆菌蛋白质组中一个新的去乙酰化酶家族YcgC。2.2 平面型微阵列检测芯片的应用平面型微阵列检测芯片在多个领域得到了广泛应用[44-47]，包括但不限于筛选血清生物标志物、识别新的酶和底物、研究病原体与宿主间的相互作用等。2.2.1 筛选血清生物标志物淀当人体出现病原体感染或内源性蛋白异常表达（数量增加或种类改变）的情况时，免疫系统将产生识别病原体或异常蛋白的特异性抗体。这些特异性抗体的存在是筛选血清生物标志物的物质基础。一旦被识别和确认，这些抗体和相应的目标分子就可以进一步用于临床诊断和疫苗开发[24]。Kuo等[48]和Song[49]等利用平面型微阵列芯片30生命科学仪器 2020 第18卷 /08月刊综述限于探针的固定量，在某些情况下可能会出现检测动态范围不足的问题[58]。作为一种应用广泛的分离分析介质，微珠在图2 用于筛选大肠杆菌蛋白质组中去乙酰化酶的“夹子芯片”原理示意图[52]Fig.2 Schematic of clip-chip for screening the whole E. coli proteome to discover enzymes with deacetylase activity[52]生化分析中的应用已经有50多年的历史了[60]。与平面型微阵列检测芯片相比，基于微珠阵列的检测芯片具有如下优势：（1）微珠具有更高的比表面积，可以固定更多的捕获探针分子，检测的动态范围更广；（2）微珠上固定的捕获探针与目标分子之间可以达到近似溶液反应动力学的结合效率，检测过程更快，灵敏度可以达到甚至超过ELISA的水平[61]；（3）微珠的大规模制备和表面改性较易实现，制备完成的微珠可以在溶液中储存，而且固定了不同捕获探针的微珠经过编码后，可以进行选择性混合，从而根据需要更灵活地完成多种目标分子的并行检测[62]；（4）微珠阵列检测芯片与相关微流控设备相结合，可以显著提高检测的自动化程度[63]。 微珠阵列检测芯片由微珠和固相载体组成。微珠的表面经过功能化后，进行特异性捕获探针（如抗体或核酸适配体）的修饰，再装配到固相载体（如硅、玻璃或聚合物）上，用作蛋白质的高通量并行检测平台[64]。微珠阵列检测芯片上每种微珠携带的捕获探针的“身份”可以从其固定位置得知，因此不需要对微珠进行额外编码[59]。Yu等人[53]开发了一种基于人蛋白质组微阵列芯片的底物鉴定方法。通过该方法，分别发现了27种VopS和29种IbpAFic2的潜在底物。除此之外，平面型微阵列检测芯片还可用于酶活性的测定[54]以及酶抑制剂的筛选[55]等。2.2.3 研究病原体与宿主间的相互作用病原体与宿主之间的相互作用非常复杂。对这些相互作用的研究有助于阐释病原体的致病机制、识别新的药物靶点、开发新药和治疗策略等。而平面型微阵列芯片技术为全面解码病原体与宿主间的相互作用提供了一个很好的研究平台。研究人员通常将来自病原体（或宿主）的蛋白质与宿主（或病原体）的蛋白质组微阵列芯片共同孵育，对该蛋白质的潜在结合目标进行高通量筛选。Yu等人[56]利用人蛋白质组微阵列芯片分别筛选出了18个嗜肺军团菌效应因子SidM的潜在结合目标和20个LidA的潜在结合目标。研究这些蛋白质的特性有助于深入了解病原菌的侵染过程。Hsiao等人[57]以四种宿主糖胺聚糖为探针，筛选病原体蛋白质组中的结合蛋白，分别鉴定出185个、62个、98个和101个与肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素B和硫酸软骨素C结合的蛋白。其中，YcbS被进一步鉴定为一种新的细菌毒力因子。3.1 微珠装配方法在免疫分析过程中，装配在微珠阵列检测芯片上的微珠需要维持其相对位置并保持稳固。为此，研究人员开发了多种微珠装配方法，如静电自组装、电场或磁场辅助组装以及物理限制法等。前两种方法可以稳定地固定微珠，但它们只有在微珠表面带电，或具有磁性时才能使用。相比之下，物理限制法通过微观结构来固定微珠，不依赖微珠的物理或化学性质，不需要复杂的仪器设备，是最简单直接的微珠装配方法。Zhu和Trau采用聚丙烯酰胺凝胶制作微阵列芯片，分别将包被有人体绒膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, hCG）和前列腺特异性抗313、微珠阵列检测芯片及其应用相比于以ELISA为代表的传统检测方法，平面型微阵列检测芯片在设备小型化、自动化、样品消耗微量化及高通量多目标检测等方面都展现出了优势。但是，由于不同蛋白质的表达范围差别很大（~106倍），而平面型微阵列检测芯片受综述生命科学仪器 2020 第18卷 / 08月刊原（prostate specific antigen, PSA）单克隆抗体的微珠装配其上，对上述两种肿瘤标志物实现了高灵敏度的并行检测。需要指出的是，上述方法一次只能处理一个生物样品，且样品消耗量相对较大（20 μL），为解决这一问题，作者们又对检测体系进行了优化。他们在一块载玻片上集成了40个凝胶垫阵列单元，并且每个单元均被聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）制成的微柱所包围，亲水性聚乙二醇微柱将样品和试剂限制在每个单元的上方，减少了流动和蒸发[65]。经过优化后的微珠阵列检测芯片可同时对40个不同样本进行免疫检测，并且单个样品消耗量减少到1 μL（图3）。理过程主要包括识别信号位置、确定信号强度并减去背景噪声信号等。最后一步是将提取的数据转化为有价值的生物信息，如生物标志物的表达量等[70]。计算机软件的使用显著提高了分析的自动化程度，减少了人为因素对结果阐释的影响。目前已经出现了一些商业化系统，例如MesoScalediscovery（MULTIARRAY/MULTI-SPOT）和FastQuant（FAST Quant System）具有同时检测10种目标的能力，Searchlight系统则可以实现多达24种目标分子的并行检测，成为商业化应用的典例。4、 悬浮微阵列及其应用微珠阵列检测芯片在微珠的作用下，将大量的编码和浓度信息集中到了一小片固相载体上，在高通量、高密度检测中发挥着重要作用。但其在微珠与芯片结合率、解码速度、检测结果质量图3 高集成度凝胶垫阵列检测芯片（A）在一块载玻片上集成40个聚丙烯酰胺凝胶垫阵列单元，（B）一个凝胶垫阵列单元和聚乙二醇微柱，（C）一个凝胶垫阵列单元[65]Fig. 3 High-integrated gel pad array chip. (A) Fabrication of 40 polyacrylamide gel pad array units on a glass slide, (B) A gel pad array unit with PEG micropillars, (C) A gel pad array unit[65]以及整体灵活性等方面存在着一定的局限性[71]。而悬浮微阵列技术由于不再使用固相材料作为载体，采用了更高效的混合方式以增强微珠与目标分子的结合动力学，并可通过流式细胞仪直接读出检测信号，不依赖荧光图像。因此可以很好地解决上述问题（图4）[59]。另一种用于微珠固定的物理微结构是以微加工的方式，在载体上构建的网格状微孔阵列。这种方式在实现单个微珠分离的同时，还有助于通过每个微珠的x、y坐标对其进行识别[66]。Kan等人[67]构建了基于环烯烃聚合物（copolymers of cycloolefin, COP）注塑成型的微珠阵列检测芯片，每个芯片包含24个微孔阵列，每个微孔可以容纳2×105个微珠，实现多样本多目标的高通量并行检测。此外，微珠的装配效率还可以通过离心或施加负压等方式进行提高[68, 69]。图4 （A）微珠阵列检测芯片和（B）悬浮微阵列示意图[59]]Fig.4 (A) Microbead array chip and (B) Suspension microarray[59]悬浮微阵列由几组经过编码的聚合物微珠混合形成，每组微珠表面偶联有特定的抗体或其他捕获探针，用于特定目标分子的识别和捕获。由于不再使用对微珠进行空间分离的固相载体，因此每个微珠都有一个独特的光学编码，用于识别微珠表面的探针及其特定的目标分子的种类[59]。基于悬浮微阵列的高通量免疫检测在基础科研和3.2 信号检测与分析微珠固定后，芯片与样品混合孵育，功能化的微珠与样品中的抗原或抗体相结合，再通过检测探针进行荧光标记；最后在特定的激发波长下，荧光图像被CCD相机捕获，并通过专用软件完成图像的处理和注释工作[64]。其中图像处32生命科学仪器 2020 第18卷 /08月刊综述临床诊断领域得到越来越广泛的关注[72]。基于悬浮微阵列的检测系统通常由以下两部分组成（图5）：（1）经过编码的可用于多路复用的功能性微珠；（2）与微珠编码方式和待测信号类别相匹配的信号采集装置[61]。色激光产生的光致激发效应，对微珠中红色与橙色荧光分子的含量进行表征，解码每个微珠对应的目标分子的种类；而目标分子的浓度信息则从绿色激光产生的光致激发效应中获得，这是因为绿色荧光来自于目标捕获后加入的检测探针[61]。Gorelik[77]等人充分利用了Luminex系统的多路复用能力，对血清中的多种卵巢癌相关标志物（细胞因子/趋化因子、生长因子、抗原）同时进行检测，与传统检测方案中仅采用CA-125这一种标志物相比，他们的检测方案显示出更加准确地诊断能力。图5 基于悬浮微阵列检测系统原理图[61]Fig.5 Schematic illustration of a detection system based on suspension microarray[61]4.1 荧光编码的悬浮微阵列悬浮微阵列中，与目标分子特异结合的捕获探针被固定在微珠上，为了满足高通量并行检测需求，需要通过编码的方式对修饰不同捕获探针的微珠进行区分。包括化学编码、电子编码、图形编码和荧光编码等在内的编码方法已经被提出和证明[73,74]。在上述所有编码方法中，荧光编码由于具有编码过程简单，生物分子相容性好，荧光分子可选择性激发以及荧光信号采集系统发展较为完善等优点，在蛋白质检测方面得到了最为广泛的应用[75]。图6 （A）荧光染料编码微珠的悬浮微阵列，Luminex xMAP系统包含100个直径5.6μm的聚苯乙烯微珠,（B）微珠在快速流动中被识别，红色激光对微珠的光学编码信息进行解码，绿色激光用于测量探针的荧光强度，从而进一步实现目标分子的量化（由Luminex公司提供）Fig.6 （A） A suspension microarray encoded by fluorescent dyes, Luminex xMAP system consists a panel of 100 distinct 5.6-μm polystyrene microbeads.（B） The microbeadsAre identified individually in a rapidly flowing fluid stream. A red laser reveals the code of the bead, and a green laser quantifies target molecules by measuring the fluorescence intensity of the probe. ( Courtesy of Luminex Corporation).4.1.1 有机荧光染料编码的悬浮微阵列在有机荧光染料编码的悬浮微阵列由携带不同荧光编码信息的微珠组成。这种荧光编码微珠是通过将有机荧光染料嵌入聚苯乙烯微珠中制备得到的。通过控制有机荧光染料的种类（如罗丹明异硫氰酸酯、Cy系列染料或Alexa Flour系列染料等）和浓度，可以生成多种编码信息。一个典型的例子是已经商业化的Luminex蛋白检测系统[76]4.1.2 量子点编码的悬浮微阵列尽管有机荧光染料编码的悬浮微阵列已经投入商业化应用。然而，这种方法要求每种编码的荧光染料的光谱特性（激发光谱和发射光谱）都能被光学系统完整地分辨出来，因此，这样的检测系统往往需要能够产生多频段激发光的复杂光学系统。加之荧光染料种类有限且光谱特征又存在广泛的重叠现象，有时会引起错误识别[78]。为了解决上述问题，研究人员提出以量子点（quantum dots, QDs）代替有机荧光染料的编码方式。量子点又被称为半导体纳米微晶体33，如图6所示。在Luminex 100/200系统中，所使用的荧光微珠是掺杂特定比例的红色与橙色荧光染料的聚苯乙烯微珠（直径5.6 μm）。通过红综述生命科学仪器 2020 第18卷 / 08月刊（semiconductor nanocrystals, SNCs），是一种由II–VI族元素组成的纳米颗粒，粒径约1-100 nm，光学特性与多环芳香烃等分子很相似，可以发射荧光，且光发射与吸收的特征严格受到其体积大小的控制。与传统的有机荧光染料相比，量子点具有一些新特点：激发波段宽，发射峰窄而对称，不易互相重叠和干扰；荧光强度和稳定性高；发射波长可通过控制其大小和组成来调谐；生物相容性好等等。因此基于量子点编码的悬浮微阵列可以克服有机荧光染料的种类有限且光谱特征重叠等缺陷[79]。理论上，通过组合几种不同发射波段的量子点种类以及含量，就可以产生10,000-40,000种不同的编码。目前为止，已经有很多应用量子点光学编码微珠进行多重免疫检测的报道。Han[80]等人通过调整嵌入聚苯乙烯微珠中的两种具有不同发射波长（450 nm和520 nm）的量子点的含量，获得了多种可用于高通量免疫检测的光学编码微珠。Bilan[81]等人采用交替带电聚合物层和水溶性量子点的分层沉积方法，通过组合三种颜色以及两种浓度的量子点，制作了八种光学编码的微珠（图7），这些微珠可在单一激发波长下，在流式细胞仪的三个通道中被清晰识别出来。获的目标分子结合是最普遍的方法。然而，上述标记方法存在着成本高、耗时长及荧光信号不稳定的缺点，加上可用于双抗体夹心法的抗体对数量有限，也在一定程度上限制了这种方法的多路复用能力[72]。无标记检测方法基于微珠表面发生的相互作用所引起的结构变化来实现检测，不通过荧光探针标记，避免了上述问题。4.2.1 基于聚二乙炔的无标记检测方法聚二乙炔（polydiacetylene，PDA）材料具有肉眼可见的蓝色，但随着表面探针和目标分子结合的发生，颜色会发生改变。这种颜色改变可用于蛋白质、细菌及病毒等的检测。以这种材料制成的功能性微珠用于免疫检测时，当目标分子与固定在微珠表面的捕获探针结合后，微珠会从蓝色变为红色，可进一步通过显微镜成像或流式细胞术进行分析[82]。基于PDA的悬浮微阵列同样可以结合荧光编码的方式进行多路复用检测。为了将PDA与光学编码微珠结合，可以采用多层荧光编码微珠，即核-壳型微珠。首先，制备具有光学编码性质的微珠，然后，将PDA涂覆在微珠上。这种PDA包被的微珠既具有光学编码能力，又可以根据外层颜色变化的传感信号指示目标分子的结合情况。将PDA与生物素单体或炔基的结合作为PDA的功能化方法已见诸报道[83]。然而，除与目标分子结合会发生颜色变化之外， PDA的颜色还会随压力、pH、温度等条件的变化而变化，因此在高通量蛋白质检测方面的应用会受到一定限制。图7 通过分层沉积三种颜色、两种浓度的量子点的方法，形成八种光学编码[83]Fig.7 Eight optical codes are generated by layer-by-layer deposition of QDs with three different colors and two different concentrations4.2.2 基于分子信标的无标记检测方法基于分子信标（Molecular beacons，MBs）的蛋白质检测方法也可以与功能化微珠相结合，作为一种无标记检测方法。具有发夹结构的MBs与互补的核酸或蛋白质分子结合后，可自行发生构象变化，激活荧光共振能量转移（Förster resonance energy transfer，FRET）过程[84,85]，实现4.2 标记与无标记检测方法悬浮微阵列除了通过编码的方法识别目标分子种类，还需要标记步骤来监测分子之间的特异性结合。使用荧光标记的检测探针与微珠表面捕34生命科学仪器 2020 第18卷 /08月刊综述对目标分子的定量检测。MBs可通过静电作用固定在微珠表面，识别溶液中的目标分子[86]。然而，MBs在微珠表面的附着量是随机的，且MBs与目标分子的结合也不够稳定[61]。后来，研究者们开发了通过共价键直接将MBs与荧光编码微珠偶联的固定方法。Jun等[87]采用RNA适配体检测凝血酶。将RNA探针设计为发夹结构，一端与荧光染料结合，另一端固定在含有淬灭基团、带有荧光编码的核-壳结构的微珠上。如图8所示，当微珠上的MBs与凝血酶结合时，MBs上的荧光基团与猝灭基团的空间距离变长，绿色荧光恢复（488 nm）；而在与凝血酶结合之前，微珠只表现出中心层编码染料罗丹明的红色荧光（543 nm）。此外，诸如表面等离子共振、碳纳米管及纳米线等技术的引入均可以对基于悬浮微阵列的无标记免疫检测方法的检测性能进行深度完善[88]。装配和信号分析技术以及悬浮微阵列的编码技术等，还讨论了结合PDA和分子信标进行无标记检测的方法。尽管基于微阵列的高通量蛋白质检测技术取得了很多研究成果，但为了使微阵列技术在关键领域得到更广泛的应用，仍有一些问题需要解决，例如：（1）平面型微阵列检测芯片具有很强的多重检测能力，可以实现超高密度检测，但存在结合效率低、重现性差、动态范围小等问题。（2）悬浮微阵列在反应和检测效率、重现性等方面优于平面型微阵列检测芯片和微珠阵列检测芯片，并且整体灵活性更高。但受限于编码材料的数量，尚未实现无限制编码的可能性，且不同的信号强度和信号复杂度会在一定程度上限制编码的容量。但由于悬浮微阵列的解码和信号检测可以借助流式细胞仪来实现，具有性能优良，可快速投入使用的特点。因此相比于平面型微阵列检测芯片和微珠阵列检测芯片，悬浮微阵列检测技术更具优势。（3）无标记的检测技术在一定程度上可以解决标记方法存在的抗体对数量有限及交叉反应等问题。但为了实现高通量、快速、灵敏的检测，图8 基于光学编码微珠和分子信标的无标记检测方法检测凝血酶过程示意图[87]Fig.8 Schematic illustration of a label-free method for thrombin detection based on optically encoded microbeads and MBs[87]无标记的检测技术需要克服结合效率不高、重现性较差的问题，并且可用探针的数量也需进一步扩展。目前国内外对“即时检验（point-of-care testing，POCT）”设备研发与生产的需求越来越强。而微阵列检测技术的出现代表着高通量蛋白质检测平台向微型化、便携化方向发展的趋势，未来的研究还将集中在降低成本、简化操作流程、提高检测效率等方面。将微阵列技术与POCT设备结合，可以在各种低资源环境下实现简单、快速、低成本的检测。5、结论与展望蛋白质检测在疾病筛查、重症监测和传染病防控等领域发挥着重要作用。微阵列技术的出现弥补了传统检测方法存在的样品消耗量大、操作复杂、耗时长以及多重检测能力不足等问题，具有广泛的应用前景。微阵列技术可分为平面型微阵列检测芯片、微珠阵列检测芯片和悬浮微阵列三个主要方面，具有各自的优势和不足。本文从这三个角度入手，在介绍检测原理及应用的基础上，重点关注了平面型微阵列检测芯片的表面修饰和探针分子打印技术、微珠阵列检测芯片的参考文献[1] Catalona W J, Smith D S, Ratliff T L, et al. 35综述生命科学仪器 2020 第18卷 / 08月刊Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer.[J]. 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